ELISA komplektu testēšanas prasības

Formālajā pārbaudē veiciet labu kontrastu, ir jāņem pozitīvās un negatīvās kontroles testa apstākļi, un pārbaudāmie paraugi jāizgatavo divos eksemplāros, lai nodrošinātu testa rezultātu precizitāti.

Dažreiz fons ir augstāks, kas liecina par nespecifisku reakciju, var noslēgt ar aitas serumu, trušu serumu vai BSA.

Eksperimenta apstākļu izvēle

ELISA testā ir svarīgi izvēlēties dažādus eksperimentālos apstākļus, tostarp: (1) Cietās fāzes nesēju izvēle: daudzas vielas var izmantot kā cietās fāzes nesējus, piemēram, PVC, polistirolu, poliakrilamīdu un celulozi. Tas var būt ieliektas plāksnes, mēģenes, lodītes utt. formā. Pašlaik to parasti izmanto 40 iedobēm polistirola ieliektām plāksnēm.

Neatkarīgi no tā, kāda veida nesējs, pirms lietošanas var veikt skrīningu: ar tādu pašu daudzumu antigēna iepakojuma tādos pašos eksperimenta apstākļos ir jāreaģē, lai novērotu, vai tā krāsu atveidošanas reakcija ir viendabīga, saskaņā ar kuru tā ir laba adsorbcijas veiktspēja. (2) Iepakojums pēc antivielu (vai antigēna) atlases: antiviela (vai antigēns) adsorbēta uz cietās fāzes nesēja virsmas, prasības nopietnība ir labāka, adsorbcijai parasti ir nepieciešams pH no 9,0 līdz 9,6. Adsorbcijas temperatūrai, laikam un olbaltumvielu daudzumam ir arī noteikta ietekme, parasti vairāk nekā 4 ° C 18 līdz 24 stundas. Proteīna iepakojumu optimālā koncentrācija ir jātitrē: pēc iepakošanas ar dažādām proteīna koncentrācijām (0,1, 1,0 un 10 μg/ml utt.), pozitīvo paraugu OD vērtības tiek novērotas, kad citi testa apstākļi ir vienādi. Izvēlieties koncentrāciju ar lielāko OD vērtību un mazāko proteīna daudzumu.

Lielākajai daļai olbaltumvielu tas parasti ir no 1 līdz 10 μg/ml. (3) Ar enzīmu -marķēto antivielu darba koncentrācijas atlase: pirmkārt, sākotnējais titrēšanas efekts, izmantojot tiešo ELISA metodi (skatiet enzīmu -marķēto antivielu daļu).

Pēc tam fiksējiet citus nosacījumus vai izmantojiet "kvadrātveida masīva metodi" (sagrauzts, pārbaudāmā parauga atsauce, un ar enzīmu -marķētās antivielas ir dažādi atšķaidījumi) formālajā eksperimentālajā sistēmā precīzi titrē tās darba koncentrāciju. (4) Fermenta bāzes un ūdeņraža donora izvēle: ūdeņraža donora izvēle ir lēta, droša, ar skaidru krāsu{3}}atveidošanas reakciju un pati par sevi ir bezkrāsaina. Dažiem ūdeņraža donoriem (piem., OPD u.c.) ir iespējama kancerogēna iedarbība, tāpēc ir jārūpējas par aizsardzību. Nosacītiem cilvēkiem ir jāizmanto ne-kancerogēni, ar augstu jutīgumu ūdeņraža donori, piemēram, TMB un ABTS pašlaik ir apmierinošāki ūdeņraža donori. Pēc darbības perioda, lai apturētu reakciju, jāpievieno spēcīgas skābes vai sārmi. Parasti substrāta iedarbības laiks ir līdz 10-30 minūtēm. Pamatnes lietošanas šķidrums jāsagatavo svaigi, īpaši, ja pirms lietošanas tiek pievienots H2O2.